Nature子刊：北京大学王凯团队等通过瞬时激活NKX3.1，高效驱动iPS细胞分化为壁祖细胞

近日，北京大学基础医学院王凯课题组与哈佛大学医学院/波士顿儿童医院Kaifu Chen和Juan M. Melero-Martin研究团队合作，在 Nature Communications 期刊发表了题为 Robust differentiation of human pluripotent stem cells into mural progenitor cells via transient activation of NKX3.1 的研究论文【1】。

该研究通过在中胚层祖细胞瞬时激活NKX3.1，能高效驱动其分化为壁祖细胞（mural progenitor cells，MPCs）。这些由iPSC来源的壁祖细胞（iMPCs）在与内皮细胞（ECs）共培养后能够进一步成熟为不同的功能性壁细胞亚群，包括平滑肌细胞和周细胞。这些iMPCs具有关键的壁细胞功能，如收缩性、细胞外间质沉积，以及支持内皮细胞介导的血管网络形成的能力，在血管修复和再生医学应用方面拥有巨大潜力。

研究团队首先构建了利用Dox激活NKX3.1表达的iPSC细胞系。接下来建立了两步走的分化方案：第一步，使用糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR99021激活Wnt信号通路，将iPSCs分化为MePCs；第二步，在没有任何生长因子的情况下，使用Dox激活 NKX3.1，持续表达48小时。然后将获得的iMPCs在含血清的平滑肌生长培养基（SMGM）中再培养一段时间。

在NKX3.1表达激活48小时后，流式细胞术显示约99%的细胞表现为CD140b⁺和CD13⁺ 。分化结束后，能观察到细胞形态的显著变化，免疫荧光证实iMPCs中表达壁细胞特异性细胞骨架蛋白（α-SMA、SM22、calponin、vimentin）。由于NKX3.1仅短暂表达，使用化学修饰的mRNA（modRNA）转染以瞬时表达NKX3.1也能有效产生iMPCs。

接下来，研究团队从多个方面评估了iMPCs的功能性。与人壁细胞相似，iMPCs表现出在血管收缩剂刺激下的收缩性、TGF-β介导的细胞外纤维连接蛋白沉积、多种促血管生成因子的分泌（包括VEGF-A、PLGF、HB-EGF、HGF 等）、调节内皮细胞活性。

为了研究iMPCs是否可以调节内皮细胞（ECs）活性，研究团队将iMPCs与内皮细胞共培养于微流控芯片中，证实了iMPCs与ECs共培养可组装复杂血管网络，iMPCs能实现其作为壁细胞的功能。将iMPCs与ECs共移植入免疫缺陷小鼠皮下，能形成可灌注的血管，新形成的血管与宿主血管吻合，且功能正常；而单独移植ECs并不能形成可灌注的血管。移植的iMPCs包绕在移植的ECs旁，表明iMPCs参与构成血管壁。

iMPCs不仅能调节内皮细胞活性，也能响应内皮细胞的调节。分析转录组学显示，与内皮细胞共培养的iMPCs更加成熟，这也表现出iMPCs的前体细胞特征。与ECs共培养成熟的iMPCs表现为三种细胞类群，包括周细胞、收缩性平滑肌细胞、合成型平滑肌细胞。此外，iMPCs衍生的周细胞和平滑肌细胞与原代细胞相比具有较好的一致性。

这项研究证明，在中胚层细胞瞬时激活NKX3.1，是一种快捷、高效的分化获得iMPCs的方法。文中展示了两种瞬时激活NKX3.1的方法，其中通过modRNA激活NKX3.1的表达是一种无需基因编辑、非病毒、非整合的方法，在临床应用领域具有更大潜力。通过这种方法可获得患者特异性的壁细胞，可用于疾病建模和再生医学，具有广阔的转化和应用前景。

值得一提的是，2020年，彼时师从Juan M. Melero-Martin的王凯博士在 Science Advances 期刊发表了题为：Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with modified mRNA 的研究论文，利用modRNA在中胚层祖细胞瞬时激活ETV2，能高效驱动其分化为内皮细胞。这些内皮细胞在表型和功能上都表现出内皮细胞的特性，且移植入体内后能形成具有灌注能力的血管网络。

若将能瞬时激活ETV2表达的中胚层祖细胞与能瞬时激活NKX3.1表达的中胚层祖细胞以一定方式共培养，或许能高效获得具有内皮细胞、周细胞与血管平滑肌细胞的血管类器官，为临床转化与应用提供了很有潜力的研究平台。

论文链接：

1. https://www.nature.com/articles/s41467-024-52678-8